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Protocolos de Trabajo para el proyecto de Almacenamiento de Semillas de Orquídeas para el Desarrollo Sustentable

(Orchid Seed Stores for Sustainable Use PROTOCOLS, Seaton 2008)

Identificación de especies

  1. Localice los datos de colecta de las plantas padre (donadora de polen) y madre (flor polinizada) y seleccione los datos relevantes.
  2. Determine si hay un espécimen testigo en su colección de herbario asociada.
  3. Si no hay espécimen de herbario, debe incluir uno nuevo si es posible.  Debe incluir flores y hojas como mínimo, y ser catalogado debidamente en el herbario asociado.
  4. Si cualquiera de lo anterior falta preservar al menos una flor en líquido e integrarla al herbario.
  5. Cómo mínimo debe haber un record fotográfico (o dibujo científico) de la flor, en sus vistas frontal y laterales, así como de la planta completa.
  6. Asocie estos records con la base de datos de especímenes de herbario y los datos de colecta originales.

Colecta de campo

  1. Esta actividad debe cumplir con las regulaciones pertinentes de las entidades administrativas de recursos naturales apropiados según el país y no hacerla sin conseguir los permisos correspondientes antes.
  2. Tome fotografías del hábitat y tome los datos de campo apropiados (por ejemplo, altitud, temperatura ambiental; forofito (árbol hospedero) para epifitas, si es posible; condiciones del suelo, niveles de luz).

Polinización

  1. Como norma trate de cruzar diferentes clones, esto nos sirve para asegurar que estamos produciendo progenie genéticamente lo más variable posible.  Si no es posible ya que solo tenemos disponible una planta de una especie muy rara, se acepta la autopolinización.
  2. Escoja plantas sanas y vigorosas.  Es más probable que produzcan cápsulas con grandes cantidades de semillas viables.
  3. Cuando sea posible, polinice varias flores por planta.  Cuando un espécimen tenga múltiples flores, polinice un máximo del 10% de las flores.
  4. Polinice las flores recién abiertas.  Esto aumenta la probabilidad de éxito en la polinización ya que el envejecimiento de flores y polen disminuye su viabilidad (potencial reproductivo).
  5. Para maximizar el número de semillas por cápsula, se debe colocar una carga completa de polen en el estigma de cada flor polinizada (esto quiere decir el número máximo de polinias disponibles por flor individual)
  6. Etiquete la cápsula con los datos del donador de polen y mantenga un registro de los procedimientos realizados.
  7. Anote cuántas flores fueron polinizadas y cómo fueron polinizadas (por mano o por polinización natural).

Cosecha de Semillas

  1. La observación regular del desarrollo de las cápsulas es recomendado, incrementando a observaciones diarias cuando se acercan a la madurez.  Generalmente, las cápsulas cambiarán de verde a amarillo mientras más maduras estén.  Aun así, juzgar la madurez de las cápsulas para cada especie puede ser cosa de experiencia.  El tiempo de desarrollo de las cápsulas variará ligeramente de acuerdo con las condiciones ambientales.
  2. Registre las condicione ambientales conforme las cápsulas maduran (por ejemplo, datos de temperatura del invernadero).
  3. No coloque bolsas alrededor de las cápsulas en maduración (para prevenir pérdida de semillas), ya que la cápsula tiende a “sudar” y esto puede hacer que se pierda la cápsula completa debido a infecciones bacterianas o fúngicas.
  4. Asegúrese de anotar la fecha en que colectó las cápsulas de semillas y cuando se inicia a abrir cada una de las cápsulas (dehiscencia).  Fotografíe la cápsula al momento de la cosecha, si es posible.
  5. Calcule y registre el tiempo que le llevó alcanzar la madurez a la cápsula para poder asociarlo con la calidad de las semillas obtenidas.
  6. Las cápsulas que no se han abierto y han sido removidas de la planta madre, pueden dejarse abrir “naturalmente” en un beaker (vaso de precipitar) pequeño o en un recipiente similar en un cuarto frío y seco.

Procesando la semilla

  1. Para reducir la contaminación y los fragmentos de desechos, corte ambos extremos de la cápsula de semillas.
  2. Para remover las semillas de la cápsula, presione gentilmente la cápsula por ambos extremos.
  3. Quisiéramos saber aproximadamente el número de semillas de todas las especies dentro del proyecto (más de 250 especies).  Para poder lograr esto, sugerimos pesar todas las semillas de al menos 3 cápsulas (más si es posible) de forma separada.  Una sub-muestra pequeña de semillas puede pesarse en una balanza analítica con una precisión de al menos 7 cifras decimales, si está disponible, y el número de semillas en la sub-muestra debe ser contada.  Esta información puede ser usada para calcular el número de semillas en cada cápsula.

Se les entregará una pequeña cantidad de tubos de almacenamiento (tapadera gris) que puede ser colocada dentro de los tubos universales grandes (tapadera azul), junto con un paquetito de sílica gel con indicador naranja.

Así empacados se pueden colocar los tubos universales (tapadera azul) dentro de los botes grandes cerrados a presión y sellados.
Almacenamiento de semillas

  1. Trate de obtener un buen tamaño de muestra (20.000 semillas o más si es posible).
  2. Agrupe las muestras de las cápsulas de cada especie y mezcle bien (esto ayudará a mantener una diversidad genética mayor por frasquito).  Guarde semillas de plantas individuales de forma separada solamente si hay suficiente material para dar un tamaño de muestra aceptable (llenar un frasquito).
  3. Seque y equilibre la humedad de las semillas sobre una solución saturada de cloruro de litio (LiCl).  La humedad relativa alcanzada con el LiCl es de 12% aproximadamente a 20 C.
  4. Para preparar la solución saturada, disuelva la sal en agua tibia hasta que el exceso de cristales se mantenga en el fondo del recipiente.  Hierva gentilmente hasta disolver todos los cristales.  Al irse enfriando, algo de la sal puede cristalizarse y mantenerse en el fondo del desecador.
  5. Coloque las semillas en una capa fina en el desecador (sellado con vaselina), por siete días a una temperatura aproximada de 15ºC.
  6. Rápidamente transfiera las semillas (para evitar el cambios en el contenido de humedad relativa) a tubos herméticamente sellados.  Los tubos deben estar lo más lleno posible, para que las semillas dominen el espacio disponible.
  7. Los frascos más pequeños pueden almacenarse dentro de tubos más grandes, dentro de un jarrón grande sellado y presurizado.
  8. Todos los tubos individuales y sus contenedores deben estar etiquetados.
  9. Los frascos de almacenamiento deben tener paquetitos de sílica gel anaranjada como indicador de humedad (no como desecante).  Esta sirve para facilitar la localización de frascos en los que se ha roto el sello y a los cuales ha entrado aire húmedo.  Antes de introducirlos, la humedad de los paquetitos de sílica gel debe equilibrarse sobre una solución saturada de LiCl también.  La sílica gel anaranjada empieza a cambiar a verde cuando la humedad relativa se acerca a 22%.
  10. Mantenga guardados los frascos en un congelador alrededor de los -20ºC.

Cuantificación de la germinación

  1. Dibuje (o fotografíe) su criterio de germinación.  Un criterio clave es la separación de la cubierta de la semilla (testa), pero los criterios pueden variar entre especies.  Por ejemplo, el criterio para especies epifitas puede ser la aparición de rizoides y el aparecimiento de color verde en el protocormo.  Especies terrestres pueden no desarrollar los rizoides, y normalmente germinan en la obscuridad, por lo tanto no desarrollan color verde en esta etapa.
  2. Califique todas las semillas y regístrelas en las siguientes 3 categorías: vacía, potencialmente incompetente (por ejemplo con un embrión anormalmente pequeño), potencialmente viable (por ejemplo con un embrión completo).
  3. Registre la germinación de las semillas completas (o sea de las viables).
  4. Siembre las semillas en al menos dos diferentes medios.   Los medios deben tener composiciones químicas contrastantes.  Sugerimos que todos usen Knudson C como uno de los medios escogidos, ya que esto nos permitirá comparar entre las más de 250 especies conservadas por los miembros del proyecto en un medio común.
  5. Siembre un mínimo de 100 a 200 semillas por caja Petri. Aunque números menores de semillas (por decir 50 semillas) son aceptables cuando hay números muy bajos de material disponible, por ejemplo cuando las cápsulas de semillas son muy pequeñas.
  6. Disperse las semillas de forma uniforme sobre la superficie del medio.
  7. Siembre un mínimo de tres réplicas de las cajas Petri para cada especie.
  8. Registre la germinación en intervalos de un mes por al  menos 3 meses, y por hasta de 9 meses o más si la germinación sigue aumentando.  El propósito es producir curvas completas de germinación, esto es hasta alcanzar el maximo (100% de semillas viables idealmente).
  9. Cuando se han sembrado demasiadas semillas, la caja Petri puede dividirse en cuartos, evidenciados con marcador indeleble.  El mismo cuarto debe ser contado en cada ocasión.  Una pieza de papel milimetrado puede colocarse atrás de la caja Petri para ayudar en los conteos.
  10. Las especies de orquídeas terrestres de áreas templadas deben germinarse en la oscuridad.  Si es posible, el conteo de las semillas germinadas debe llevarse a cabo bajo una “luz segura” color verde (green 'safe light').
  11. Las especies epifitas tropicales deben dejarse germinar bajo luz blanca fría, fluorescente, usando un fotoperiodo de 12 horas.
  12. Las especies terrestres deben germinarse a 20±2ºC.
  13. Las epifitas tropicales deben germinarse a 25ºC.
  14. El monitoreo de las semillas de orquídeas debe llevarse a cabo en el siguiente programa:
    1. Durante el periodo OSSSU: inmediatamente después de secar, 1 mes, 1 año, 2 años.
    2. Post OSSSU: 4 años, 8 años y conteos subsecuentes.
  15. Se deben seleccionar tres contenedores al azar para cada prueba.

Recuerde anotar todo y mantener buenos registros.
Se debe iniciar lo más pronto posible el trabajo con las especies que pueden ser difíciles de germinar.